文|编辑唐文笔飞扬|唐文笔飞扬
GO和r-GO作为二维纳米材料，具有独特的化学和物理特性，使其在生物医学、电子元器件、储能等领域具有广阔的应用潜力。
但随着其应用范围的扩大，人们对其潜在的毒性作用产生了怀疑。 因此，全面的体外药理评价是保证GO和r-GO安全应用的关键。
石墨烯基纳米材料（GO 和 rGO）的细胞毒性评估
GO 和 r-GO 的细胞毒性最初是使用改良的乳酸酯酶 (LDH) 测定法进行评估的，该测定法基于细胞内 LDH 水平的量化而非 LDH 释放。
LDH 的释放可以揭示细胞膜的损伤，这是坏死的迹象，而改良的 LDH (m-LDH) 检测仅提供样品中活细胞数量的信息，不能作为坏死的指标。
然而，这些变化允许在分析之前去除多余的纳米颗粒，从而降低干扰碳基纳米材料的风险。
因此，m-LDH 测定被认为是迄今为止评估此类材料细胞毒性的最可靠方法。 GO和r-GO的评价结果表明，毒性与时间和含量有关，与细胞类型和数学物理有关。 功能相关。
更短的暴露时间（3 小时）不会对材料或细胞类型造成明显的毒性，但是，从 24 小时开始，可以观察到材料之间的差异。
对于MRC-5细胞，细胞存活率随着时间的推移和GO含量的降低而增加，最高含量条件下的细胞存活率分别为12.9±35%和5.2±27%。
细胞暴露于 GO 含量高达 1/ml 24 小时导致所有处理具有相似的功效（大约 70-60% 的细胞活力）。
但48小时后，不仅是最低的两个水平，其他水平的细胞活力均低于LD50。
相比之下，暴露于 r-GO 不会显着影响细胞活力，其在所有处理和时间点都保持在 80% 的毒性阈值附近。
对于 A549 细胞，GO 和 r-GO 显示出非常相似的细胞毒性特征，并且对于这两种材料，细胞毒性随着含量和时间的减少而逐渐降低。
虽然r-GO的毒性与MRC-5的结果几乎一致，但与健康细胞相比，GO对癌细胞的作用较弱。
事实上，24 和 48 小时后，A549 细胞在 1/ml 时的存活率是 MRC-5 细胞的两倍。
最常用的细胞毒性测定有一些局限性，因此寻求替代方法来确认细胞毒性数据。
在用于研究细胞存活的所有测量中，基于发光的分析是唯一没有报告对碳基材料产生干扰的分析。
然而，关于金属纳米粒子干扰的报告表明，使用这些检测方法可能存在问题，干扰光并不是唯一需要考虑的原因。
事实上，由于碳基材料与非胺甲唑蓝晶体的相互作用，MTT 等代谢检测可能会导致假阳性（广谱）结果。
考虑到所有这些激励措施，研究了一种新的发光测定模式 - MT - 以评估其对石墨烯纳米材料研究的适用性。
这些特定的细胞存活测定测量活细胞的还原潜力，因此不允许消除纳米材料，使该测定非常适合干扰研究。
在这种测定形式中，信号是通过将还原的 MT 底物从细胞扩散到周围介质中产生的，底物与荧光素酶结合，产生的发光信号与活细胞的数量相关。
在最初的实验中，只使用了 GO，因为它比 r-GO 具有更好的分散性。
尽管考虑了终点、敏感性和毒性机制的差异，但暴露 3 小时后获得的细胞存活结果已经表明可能存在干扰，因为这些较短的暴露时间与 GO 的明显毒性无关。
相反，-MT 细胞存活结果显示，尽管暴露于低水平的 GO (31.25ug/ml)，但细胞存活率增加了 50%。
值得注意的是，在使用改良的 LDH 测定法评估细胞毒性时，没有观察到这些毒性水平，尽管在更高的水平和 48 小时的处理时间。
众所周知，基于代谢的测定可能会低估物质对细胞代谢的影响而不影响细胞活力，因为此类测定将代谢活动描述为细胞活力的间接指标。
然而，与预期高的 m-LDH 分析数据相比，-MT 分析观察到的 GO 对 A549 细胞的显着细胞毒性在 31.25 至 125 ug/ml 范围内的所有时间点均超过了-MT 分析灵敏度。
为了阐明与 m-LDH 测定数据的差异，进行了另一项实验，其中将细胞与测定试剂一起孵育，并在 24 小时后测量荧光硬度。
确定基线后，向孔中加入不同含量的GO，立即检测荧光硬度。 结果表明，加入GO后荧光硬度显着降低。 当含量为15.6和/ml时，平均信号分别降低。 25% 和 95%。
综合所有这些结果，可以推断 GO 会干扰基于荧光的测定。 虽然没有报道，但这在某种程度上是意料之中的。 由于碳纳米材料会干扰荧光，因此这是一个密切的相关性。 现象。
据报道，GO 与测定中的试剂之间的相互作用不可忽略，很可能需要修改荧光测定，引入额外的步骤来消除纳米颗粒，类似于 LDH 测定所需的步骤。
石墨烯纳米材料的细胞相互作用
在确定了石墨烯衍生物在肺细胞中可能产生的细胞毒性作用后，我们询问细胞毒性是由于内吞作用还是与质膜相互作用。
一些研究表明，石墨烯纳米颗粒的掺入是其观察到的细胞毒性的原因，而另一些研究表明，石墨烯掺入细胞可以提供治疗性抗生素而不会对细胞造成损害。
纳米粒子进入细胞需要不同的能量依赖性内吞过程。 内吞途径有多种类型，包括吞噬作用，它可以主动将大颗粒（>）内吞到吞噬细胞中。
据报道，内吞作用根据纳米粒子的大小分为多种机制，即微吞噬作用（
非吞噬细胞如 A549 和 MRC-5 也可以摄取小颗粒。 研究中石墨烯衍生物的平均粒径主要大于。 预计它们在 MRC-5 和 A549 细胞中的内吞作用将通过细胞内吞咽机制进行。
一些纳米粒子有可能通过质膜被动扩散进入细胞，例如，据报道碳纳米管通过穿透质膜进入细胞。
荧光染色通常用于研究纳米粒子如何被细胞吸收，然而，信号淬灭使这些方法不适用于石墨烯纳米材料。
Al-He 提出了一种替代方法，该方法基于流式细胞术对光散射变化的定性评估。
具体来说，这种方法基于碳基纳米材料与细胞的结合，导致粒径减小，进而转化为侧向散射分布的变化。
侧向散射模态已成功用于研究碳纳米管、氧化锌、二硅氧烷和银纳米粒子的摄取，虽然难以区分纳米粒子的细胞吸附和细胞内吞，但有望进一步改进。 提供有关石墨烯纳米材料与细胞相互作用的有用信息。
在本实验中，细胞暴露于 /ml 的最高浓度，由于石墨烯衍生物在较高浓度下表现出的高细胞毒性，细胞计数可能较低。
实验已知，侧向散射分布没有变化表明纳米材料与 MRC-5 和 A549 细胞之间的相互作用可以忽略不计。
这在一定程度上挑战了细胞毒性数据，特别是在 MRC-5 细胞的情况下，在 /ml 的 GO 处理 48 小时后观察到的低细胞活力表明细胞和纳米材料之间存在某种关系。 相互作用。
GO 和 r-GO 细胞毒性的机制评估
细胞暴露于细胞毒性物质会导致不同类型的细胞死亡，其中一个例子是被称为坏死的无意细胞死亡。
坏死过程表现为快速的细胞疼痛和膜完整性的丧失，导致细胞内物质释放到周围环境中。
坏死性细胞死亡不是细胞死亡的唯一形式，细胞也可能经历自噬，这是一种高度调节的细胞自杀过程。
自噬的标志包括细胞质收缩、细胞膜破裂、细胞核凝缩和明确无误的破裂。 除了自噬和坏死，端粒是细胞死亡的另一种机制。
端粒是一种循环系统，可以分解异常的蛋白质团块、细胞质成分和受损的细胞器，然而，不受限制的细胞凋亡可能导致非自噬性细胞死亡。
据报道，端粒功能的破坏会导致细胞损伤并导致细胞死亡，这被认为是纳米材料毒性的潜在机制之一。
纳米颗粒毒性的机制已得到广泛研究，据报道，不同类型的纳米材料可以通过在许多生物系统中形成活性氧 (ROS) 来诱导毒性。
ROS 的过量形成会导致氧化应激，这种情况会导致不受控制的细胞信号传导、细胞运动的变化、遗传毒性、致癌作用、自噬和自噬，以及不同的毒性终点。
推理：
对于 GO，与细胞的化学相互作用实际上比 r-GO 更明显，这反映在对两种细胞系的细胞信号蛋白的明显影响上。
纳米颗粒可以与细胞膜受体相互作用，从而调节信号转导通路。 因此，GO纳米片与细胞膜受体的结合可能会引起信号干扰。
GO 易位到细胞中可能是观察到的细胞紊乱的触发因素，但需要进一步的工作来否认这一点。
提出GO的形状（像条状结构）可能会阻塞A549细胞表面的通道，从而干扰物质交换。
该研究还表明，GO进入A549细胞的能力较差。 因此，细胞膜对物质交换的阻断可能是GO的间接作用，导致不同细胞信号通路失调。
关于 GO 纳米片的间接作用的另一种可能性是它们从培养基中吸收营养，引起氧化应激和细胞饥饿，从而诱导细胞凋亡，这是许多研究人员报道的一种现象。
总之，GO 而不是 r-GO 可以诱导肺细胞系中细胞信号通路的失调，这些能力可能具有临床意义，也可能阐明与 GO 药理作用相关的机制。
参考：
1. 石墨烯对动物生理毒性作用的研究进展。 翁以能； 江楠； 李嘉欣； 应志宁； 杜少霆。 应用生态学杂志, 2020
2. 石墨烯材料与蛋白质的相互作用。 王小娟； 刘真真； 陈琪; 王小强； 黄芳。 物理学进展, 2019
3、氧化石墨烯在生物医药领域的应用。 杜夏夏； 舒刚; 陈宗彦。 功能材料, 2018
4. 石墨烯的制备、功能化及应用。 宗鲁彦； 常旭; 吴慧霞； 杨世平。 南京师范大学学报(自然科学版), 2016
5. 石墨烯和氧化石墨烯对细胞脂质膜损伤作用的研究。 屠宇松； 方海平。 中国科学：数学，热天文学，2016
